肝硬化是一種可導(dǎo)致肝功能衰竭的慢性疾病。目前，降低死亡率的可行選擇是肝移植。然而，移植手術(shù)是高度侵入性的。因此，已經(jīng)開發(fā)出基于細(xì)胞的療法作為替代方案。基于臨床前研究的有希望的發(fā)現(xiàn)，一些新的試驗已經(jīng)注冊。

目前肝纖維化的治療方法分為五類：

• 1) 控制原發(fā)性肝病，
• 2) 靶向HSC受體-配體相互作用和細(xì)胞內(nèi)信號，
• 3) 抑制纖維發(fā)生或基質(zhì)降解。
• 4) 減少活化HSC的數(shù)量，
• 5) 基于細(xì)胞的治療。

目前細(xì)胞的療法主要關(guān)注改善肝纖維化，但它也能夠產(chǎn)生其他有益效果（包括減少炎癥和促進(jìn)肝臟再生）。

其中之一是自體骨髓細(xì)胞輸注療法，自體骨髓細(xì)胞輸注 (ABMi) 療法的第一項臨床研究于2003年開始，其中患者自身的骨髓細(xì)胞被采集并重新注射。在這種療法中，ABMi可改善肝硬化患者的肝纖維化并改善肝功能（如血清白蛋白水平升高、腹水減少和Child-Pugh評分降低所示），而不會引起任何重大不良事件。ABM i還促進(jìn)人體肝臟中肝臟固有再生的順序激活。

現(xiàn)在，大多數(shù)試驗都集中在適合同種異體給藥的低免疫原性間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC) 上。然而，盡管進(jìn)行了大約20年的研究，只有有限數(shù)量的基于細(xì)胞的療法進(jìn)入了常規(guī)實踐。此外，基于細(xì)胞的療法的潛在缺點包括對可能施用的細(xì)胞數(shù)量的限制，以及它們無法滲透目標(biāo)器官。

另一方面，這些研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞作為“傳導(dǎo)細(xì)胞”，通過細(xì)胞外囊泡（EV）或外泌體信號調(diào)節(jié)包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的宿主細(xì)胞，從而改善肝纖維化并促進(jìn)再生。因此，利用細(xì)胞衍生的EV或外泌體的無細(xì)胞療法的概念正在引起人們的關(guān)注。無細(xì)胞療法可以安全地大劑量給藥，并且能夠滲透靶器官。

然而，無細(xì)胞療法的發(fā)展也面臨著一系列挑戰(zhàn)，而且這種療法在肝病的背景下可能無法完全治愈。這篇綜述描述了細(xì)胞療法研究的歷史和無細(xì)胞療法的最新進(jìn)展，并討論了對更有效療法的需求。

間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝硬化的現(xiàn)狀及未來無細(xì)胞治療的展望

干細(xì)胞治療：間充質(zhì)干細(xì)胞和巨噬細(xì)胞治療肝硬化的特性

間充質(zhì)干細(xì)胞的主要治療（抗炎、抗纖維化、抗氧化和血管生成）作用是由于它們的可溶性產(chǎn)物，包括趨化因子、細(xì)胞因子、營養(yǎng)因子、EV和外泌體。間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝硬化的主要機(jī)制是減少炎癥。

另一個重要的MSC特征通常是低免疫原性。臨床研究表明，它們在影響廣泛器官（包括肝臟、神經(jīng)、肺、心臟和腸道）的疾病中具有治療潛力。

巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出多樣的表型和高可塑性，包括兩種主要的代表性表型：“經(jīng)典激活”(M1) 和“交替激活”(M2)。在肝損傷期間，促炎性M1巨噬細(xì)胞通過激活HSC和肌成纖維細(xì)胞促進(jìn)纖維化。相比之下，在肝損傷過程穩(wěn)定后，M2型巨噬細(xì)胞有助于炎癥消退和纖維化逆轉(zhuǎn)，后者部分通過基質(zhì)金屬蛋白酶。此外，如前所述，巨噬細(xì)胞能夠通過產(chǎn)生HGF、OSM和Wnt3A來影響肝干/祖細(xì)胞的分化和表型命運決定。

MSC也會產(chǎn)生相同的因子（TSG-6、PGE2和IL-13），并以類似的方式促進(jìn)宿主巨噬細(xì)胞的極化。此外，我們之前曾報道過，MSC促進(jìn)宿主嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的肝臟浸潤，從而通過產(chǎn)生MMP促進(jìn)纖維化改善。這些發(fā)現(xiàn)表明，遠(yuǎn)程MSCs充當(dāng)“傳導(dǎo)細(xì)胞”（圖2)，通過包括EV或外泌體在內(nèi)的可溶性因子調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的功能，從而改善肝纖維化并促進(jìn)肝再生。

干細(xì)胞治療：間充質(zhì)干細(xì)胞和巨噬細(xì)胞治療肝病的臨床試驗

盡管MSCs和巨噬細(xì)胞都代表了用于細(xì)胞治療的有前途的候選者，但目前的大多數(shù)臨床試驗都集中在MSCs 上。根據(jù)ClinicalTrials.gov的數(shù)據(jù)，超過1,100個間充質(zhì)干細(xì)胞治療的臨床試驗已經(jīng)在各個學(xué)科注冊，其中 51個在2006年之后開始研究基于細(xì)胞的肝病治療。此后，基于細(xì)胞的治療臨床試驗注冊數(shù)量（包括骨髓、脂肪組織、臍帶組織和牙髓在內(nèi)的細(xì)胞來源，以及包括外周靜脈和動脈注射在內(nèi)的給藥途徑，隨著該方法獲得認(rèn)可，逐漸增加到頂峰。

2017年，日本注冊了一項I期和II期臨床試驗（日本首次涉及MSC的臨床試驗），重點是在肝硬化患者中輸注脂肪來源的MSC（NCT：03254758）。涉及同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞（不使用免疫抑制劑）的臨床試驗在完成I期后進(jìn)入II期。但是，自2017年以來，臨床試驗的數(shù)量一直在下降（圖3)。這種趨勢可能是由于新穎性下降，將臨床前研究轉(zhuǎn)化為臨床干預(yù)的進(jìn)展緩慢，以及將重點轉(zhuǎn)向包含EV或外泌體的無細(xì)胞療法的趨勢。

此外，為了描述以MSC為導(dǎo)向的臨床試驗的最新趨勢，我們根據(jù)ClinicalTrials.gov（表格1). 其中大部分在亞洲國家注冊。研究在細(xì)胞來源、自體與同種異體性質(zhì)以及肝硬化的病因?qū)W方面各不相同。然而，在大多數(shù)研究（12項中的11項）中，MSC給藥是通過外周注射每劑約1×10⁶MSC/kg。研究不僅關(guān)注肝硬化，還關(guān)注急性慢性肝衰竭 (ACLF)。由于MSCs在炎癥期間表現(xiàn)出更強(qiáng)的治療效果，因此它們在ACLF的情況下可能特別有效。總而言之，許多面向MSC的臨床試驗尚未超過I期或II期。

關(guān)于以巨噬細(xì)胞為導(dǎo)向的細(xì)胞療法，愛丁堡大學(xué)也報道了進(jìn)一步闡明巨噬細(xì)胞特征的臨床試驗。靜脈內(nèi)自體巨噬細(xì)胞治療的首次人體1期劑量遞增試驗納入了9名患有肝硬化和終末期肝病 (MELD) 評分為10–16的成人模型。在該試驗中，巨噬細(xì)胞是從患者單核細(xì)胞白細(xì)胞分離術(shù)衍生的單核細(xì)胞中產(chǎn)生的，該單核細(xì)胞在CSF-1存在的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。盡管巨噬細(xì)胞可能具有免疫原性，但未報告輸血反應(yīng)、劑量限制性毒性或巨噬細(xì)胞活化綜合征，并且所有參與者在1年時仍然存活且未進(jìn)行移植。

此外，1年后，9名患者中有7名MELD評分下降，9名患者中有5名肝纖維化標(biāo)志物下降。由于巨噬細(xì)胞也是肝臟再生的重要組成部分，因此預(yù)計會加速這一領(lǐng)域的研究。

干細(xì)胞治療：優(yōu)點和局限性

如前所述，基于細(xì)胞的療法具有許多優(yōu)點。尤其是對于MSC，細(xì)胞相對容易獲得、培養(yǎng)、擴(kuò)增、表征質(zhì)量控制、計數(shù)和評估活力。此外，由于MSC在炎癥過程中治療效果增強(qiáng)，預(yù)處理可以增強(qiáng)其治療效果。最后，細(xì)胞修飾的許多途徑都是可能的。盡管施用的細(xì)胞被困在肺血管系統(tǒng)中，但現(xiàn)有臨床試驗報告的主要不良事件很少，包括肺栓塞。盡管由于基于免疫原性的限制，施用的巨噬細(xì)胞是自體的，但它們現(xiàn)在可以通過侵入性較小的方法獲得。此外，在肝臟內(nèi)局部引發(fā)和影響宿主巨噬細(xì)胞發(fā)育的能力（即不需要外源性給藥）將是一個更具吸引力的可能性。

然而，基于細(xì)胞的療法也有一定的局限性。例如，對肺栓塞風(fēng)險的擔(dān)憂繼續(xù)限制劑量，并且施用的細(xì)胞不會進(jìn)入靶器官。盡管細(xì)胞確實繼續(xù)發(fā)揮遠(yuǎn)程治療作用，但直接作用于受損部位的治療劑將是更可取的。此外，鑒于干細(xì)胞的分化傾向，在長期培養(yǎng)過程中很難保持穩(wěn)定的表型。因此，商業(yè)化需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制。這種擔(dān)憂推動了對替代治療策略的探索，而無細(xì)胞療法可能會克服與細(xì)胞療法相關(guān)的一些局限性。

未來的無細(xì)胞療法：EVS和外泌體的特征

細(xì)胞自然釋放的膜結(jié)合顆粒的通用術(shù)語是EV；外泌體是這些的亞型。EV和外泌體曾經(jīng)被認(rèn)為是細(xì)胞碎片的“垃圾袋”，現(xiàn)在正在探索它們作為下一代診斷和治療工具的潛力。異類EV包含各種不同大小、不同含量的顆粒。具體而言，外泌體的直徑為40-100nm——對應(yīng)于蔗糖溶液中1.13-1.19 g/mL的密度——并且可以通過100,000×g的超速離心沉淀。它們包含蛋白質(zhì)、信使RNA、轉(zhuǎn)移RNA、微小 RNA、基因組 DNA 和互補(bǔ) DNA的混合物。

關(guān)于肝病，我們之前曾報道過MSC表現(xiàn)出遠(yuǎn)程治療效果，這是一種可歸因于EV或外泌體的現(xiàn)象。此外，據(jù)報道，外泌體可改善肝硬化小鼠的肝纖維化，在小鼠肝損傷模型中促進(jìn)肝再生和肝細(xì)胞增殖（通過上調(diào) Bclxl 蛋白），通過抑制巨噬細(xì)胞緩解急性肝衰竭NLRP3炎性體活性（另外表明它們在急性肝損傷期間的潛在效用），并改善D-半乳糖胺和腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的小鼠肝衰竭后的存活率。

未來的無細(xì)胞療法：涉及EVS和外泌體的臨床試驗

為了描述相關(guān)的近期臨床研究趨勢，我們確定了在ClinicalTrials.gov上注冊的面向EV或外泌體的臨床試驗。結(jié)果包括側(cè)重于外泌體治療應(yīng)用和癌癥診斷外泌體分析的試驗。不包括觀察性研究，注冊了26項面向外泌體的治療性臨床試驗。其中，10個專注于癌癥診斷；三個分別側(cè)重于肺部疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和皮膚病；兩個分別關(guān)注心臟病、眼科疾病和多器官衰竭，一個關(guān)注代謝疾病（圖4)。據(jù)我們所知，目前還沒有注冊以EV或外泌體為導(dǎo)向的針對肝病的臨床試驗。

未來的無細(xì)胞療法：優(yōu)點和局限性

鑒于EV和外泌體的直徑較小，靜脈內(nèi)給藥后血栓形成的相關(guān)風(fēng)險被認(rèn)為相對于干細(xì)胞（例如，MSC）所造成的風(fēng)險要低得多。如果確認(rèn)無細(xì)胞治療效果是劑量依賴性的，那么使用大量EV或外泌體的能力將是一個顯著優(yōu)勢。此外，EV或外泌體直接浸潤受損靶器官的能力可能會比遠(yuǎn)距離干細(xì)胞產(chǎn)生更大的療效。一些研究甚至檢驗了EV或外泌體在靶向藥物遞送中的應(yīng)用。

然而，盡管無細(xì)胞療法克服了與細(xì)胞療法相關(guān)的許多局限性，但前者也有其局限性。如前所述，目前還沒有用于生產(chǎn)大量EV或外泌體的標(biāo)準(zhǔn)化方法。此外，尚不清楚使用分離的EV或外泌體是否排除了基于細(xì)胞的治療相關(guān)治療效果的重要因素。最后，由于無細(xì)胞療法的快速發(fā)展，圍繞無細(xì)胞療法的相關(guān)醫(yī)學(xué)法律規(guī)范尚未充分建立。顯然，無細(xì)胞療法領(lǐng)域仍處于起步階段，需要進(jìn)行大量的進(jìn)一步研究。

結(jié)論和未來展望

基于干細(xì)胞治療肝硬化已被開發(fā)為肝移植的替代治療肝病的方法，但尚未取得超越早期臨床試驗的進(jìn)展。盡管如此，無細(xì)胞療法——克服了與細(xì)胞療法相關(guān)的一些局限性——作為下一代治療技術(shù)已經(jīng)在開發(fā)中，與肝病相關(guān)的臨床試驗有望在不久的將來開始為肝病患者帶來新的希望。

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